免疫熒光(IF)不再是難題!正常驢血清解決方案

2020-11-20 13:56:16 1759 views
摘要

經常有小夥伴對於免疫熒光的諸多問題不知所措,下面是一些免疫熒光的常見問題及優化方案詳細解答,給受困於免疫熒光的同胞們謀個福利~

經常有小夥伴對於免疫熒光(IF)的諸多問題不知所措,下面是一些免疫熒光(IF)的常見問題及優化方案詳細解答,給受困於免疫熒光(IF)的同胞們謀個福利~

免疫熒光(IF)不再是難題!正常驢血清解決方案

常見問題一:信號弱或無信號,染色細胞過少

可能原因:

1.目標蛋白在細胞中沒有表達

2.表達目標蛋白的細胞過少

3.細胞通透性差

4.染色前的固定步驟破壞了抗原表位

5.通透使抗原丟失

6.抗體不識別

7.一抗稀釋度過大

8.二抗選擇錯誤

優化方案(與以上原因相對應):

1.製備細胞裂解液,用Western Blotting驗證目標蛋白在細胞中是否表達

2.標本中使用更多的細胞,試用其他瞬時轉染方法,或者使用穩定轉染細胞系

3.增加通透劑作用的時間或者濃度,或改用其它的通透劑

4.改用其他固定方法

5.減少通透劑作用的時間或強度

6.換用其他抗體

7.同一樣品按zui佳的二抗用量作一抗稀釋曲線,以確定zui佳的一抗稀釋比例

8.使用正確的二抗

常見問題二:背景過高

可能原因:

1.一抗質量不高

2.一抗濃度太高

3.二抗濃度太高

4.封閉不完全

5.封閉液BSA中含IgG

6.洗滌不充分

優化方案(與以上原因相對應):

1.使用特異性高,效價高的一抗

2.同一樣品按zui佳的二抗用量作一抗稀釋曲線,以確定zui佳的一抗稀釋比例

3.同一樣品按zui佳的一抗用量作二抗稀釋曲線,以確定zui佳的二抗稀釋比例

4.使用二抗來源動物的非免疫血清進行封閉;改善封閉條件

5.使用高純度(IgG free)的BSA

6.充分洗滌

常見問題三:細胞呈扁平狀

可能原因:

1.細胞片被風乾

2.使用了甲醇固定

優化方案(與以上原因相對應):

1.在任何時候都不要讓細胞片乾燥;使用濕盒

2.甲醇可破壞細胞膜,因此不能很好保持細胞形態。改用甲醛或戊二醛等其他固定劑

常見問題四:細胞有自發熒光

可能原因:

1.使用了戊二醛固定

2.材料本身(如石蠟)有自發熒光

優化方案:

在固定後熒光染色前進行熒光淬滅,如使用NaIO4,NaBH4,甘氨酸等,染色前檢查自發熒光

常見問題五:細胞模糊,封片劑明亮

可能原因:

1.因洗滌不充分導致背景太亮

2.二抗結合太弱

優化方案(與以上原因相對應):

1.充分洗滌

2.確保抗體牢固結合,確保固定良好

常見問題六:整個細胞片都出現熒光亮點

可能原因:

1.二抗濃度過高

2.二抗發生沉澱

優化方案(與以上原因相對應):

1.降低二抗濃度

2.過濾或離心熒游標記二抗

以上一共提供了6個常見問題及相應優化方案,相對來說比較簡單,更好的實驗結果還是要同志們再次實驗嘗試的,其中實驗試劑的品質也是非常重要的一個環節。比如說,正常驢血清就是一個非常典型的實驗試劑,很多熱門研究領域都在使用,大家也可以根據相應問題找到適合自己的實驗試劑。

好了,今天就分享到這裡啦,喜歡的小夥伴可以關注一下哦,後期將繼續分享相關乾貨,咱們下期見哦!

文章來源:每日生物評論

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