最有希望進入臨床應用階段的種子細胞- 間充質幹細胞認識一下?

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最有希望進入臨床應用階段的種子細胞- 間充質幹細胞認識一下?

自21世紀以來,關於幹細胞的基礎研究和應用始終是國內外科研領域的一大熱點。根據我國國家自然科學基金網站的數據,每年批准的幹細胞相關的國自然課題數量從2009年開始直線上升,並在2016年達到頂峰(658個),最近幾年則仍保持在平均每年500-600個的較高水平,可見幹細胞研究的火熱。

與普通成體細胞不同的是,幹細胞具有自我更新和多向分化潛能的特性,這種特性讓幹細胞在某些領域的研究具有其他細胞所不具備的優勢。此外,近年來以幹細胞為實驗對象的研究,極大地加深了生物學家對基因轉錄、翻譯及表觀遺傳學調控等生命現象本質的認識,也推動了細胞克隆、轉基因、基因編輯等現代生物技術的發展,同時,幹細胞技術也為一些難治性疾病的臨床治療提供了新的思路。

認識間充質幹細胞(MSC)

在眾多幹細胞中,MSC是研究和應用最廣泛的一類,來源於胚胎髮育早期的中胚層,屬於多能幹細胞。1968年德國科學家Frieden Stein在骨髓中首次發現了MSC的存在,並成功在體外進行培養;1999年Pittenger等首次在體外成功將MSC誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞,證實了MSC的多向分化潛能。2006年,國際細胞治療協會(ISCT)規範了MSC的定義標準:①可貼壁生長;②細胞表面表達特定的特異性標記物;③具有向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化的能力。

MSC在機體中含量雖然不多,例如骨髓中每1~10萬個單個核細胞中僅有1個骨髓MSC,但這極小比例的MSC卻在生命活動中發揮了重要的作用。且MSC分布廣泛,截止到目前,科學家已在骨髓、脂肪、臍帶、牙髓、皮膚等多種組織中均發現MSC的存在。

MSC的臨床應用

MSC的臨床應用十分廣泛,主要集中在3個方面:①直接細胞移植治療;②作為一種理想的靶細胞用於基因治療;③作為生物組織工程的種子細胞。自2009年第一個適用於膝關節軟骨缺損修復的幹細胞藥物上市以來,截止到目前全球獲批准上市的幹細胞藥物已有14個,一半以上是MSC,主要集中在組織修復和自身免疫性疾病。而根據Clinical Trials(由美國FDA和NIH共同建立)的最新數據,全球目前有884項關於MSC的臨床研究正在進行,其中處在Ⅲ期的臨床試驗共50項,其中已完成的有16項,主要疾病種類包括克羅恩病、移植物抗宿主病、心梗、類風濕性關節炎和軟骨損傷等。

但目前MSC的臨床應用仍存在較多挑戰,雖然已經明確一些MSC的適應症並觀察到不錯的治療效果,但MSC發揮作用的調控機制仍有許多環節不明確。另外在我國,還沒有建立統一的MSC製備標準,臨床轉化過程中存在較大風險。

MSC的培養與鑒定

相比於胚胎幹細胞或神經幹細胞,MSC具有易獲取、易體外培養、傳代穩定性、低免疫原性等優勢,在體外經過多次傳代後仍具有多向分化和自我複製的潛能,且MSCs多來自於成年的組織,研究過程的道德和倫理學問題較小。

MSC的大小與形狀具有異質性,即不同種屬或不同組織的MSC具有不同的生長形態,例如三極形、長梭形、小圓形、短梭形和扁平形態。幾乎所有的MSC都是貼壁生長,具有較強的貼壁能力,而MSC的原代分離也正是利用了MSC強貼壁的特性。例如,骨髓MSC的分離方法為:將從組織中分離出來的單個核細胞懸浮培養於含有FBS的培養基中,1~2天後去除非貼壁細胞,保留貼壁細胞再培養2-3周即可獲得。此外也可採用免疫磁珠對MSC進行分選,但這種方法成本較高。

對於MSC的鑒定,常採用的方式包括形態學鑒定,表面標誌物鑒定和多系分化潛能鑒定。MSC一般呈纖維細胞樣生長,細胞在支持物表面呈梭形或不規則三角形生長,細胞中央有卵圓形核,胞質向外伸出2-3厘米長短不同的突起。MSC的細胞表面標誌物則常採用流式細胞儀進行鑒定,不同組織來源的MSCs可共享相同的細胞表面標記,如CD29和CD44。但目前我們對MSC表面分子標誌物的研究還不完善,已發現的表面標誌物也存在特異性不強的問題,為了讓我們更好地分離、培養和鑒定MSC,需進一步不斷發現新的特異性標誌物。

影響MSC細胞生長的主要因素

相比於細胞系,幹細胞對其生長條件要求更為苛刻,稍不注意可能就導致細胞生長速度過慢。那麼在培養MSC過程中應注意哪些影響因素呢?

1、血清。血清的質量對MSC的擴增起重要作用,優質的血清可保持MSC高增殖能力並維持分化潛能。

2、接種密度。傳代的密度過低會減弱細胞的自分泌和旁分泌作用,密度過高則有可能出現接觸抑制,從而導致生長緩慢。

3、細胞因子。在基礎培養基中添加一些細胞因子有助於維持MSC的增殖和未分化狀態。

4、細胞消化時間過長,胰蛋白酶作用時間太長導致細胞貼壁和生長狀態較差。