​浙江大學開發植物DNA-free基因編輯新系統

2912 人參與      分類 : 科學  

CRISPR/Cas9基因組編輯技術已成為生命科學領域的顛覆性工具,為植物生物學基礎研究提供了高效、簡便的遺傳操作手段,在作物遺傳改良和分子設計育種中也具有巨大的應用前景。植物基因組編輯通常依賴於利用農桿菌或基因槍介導的方式將CRISPR/Cas9等序列特異性核酸酶和選擇標記表達框導入受體植物細胞,在選擇性培養基中再生獲得穩定整合的轉基因植株,並進一步鑒定靶基因位點發生了穩定遺傳修飾的植株。儘管插入的外源基因隨後可通過自交或者回交手段,從編輯後代植株染色體中分離去除,但該過程仍然費時費力,尤其是對於一些倍性複雜、育種周期長或無性繁殖的植物更是如此。此外,轉化過程可造成植物基因組和表觀組發生非預期的改變或損傷【1,2】,且在一些國家基於過程(Process-based)的管理框架下,去除轉基因的編輯植物後代仍可能被納入轉基因植物的範疇進行監管,影響該技術在作物育種的應用【3,4】。因此,發展無需轉化的CRISPR/Cas9高效遞送方法,建立DNA-free植物基因組編輯技術,有助於加速作物育種進程、降低監管成本、推動基因編輯作物的產業化應用。


病毒載體系統是外源基因體內遞送和瞬時表達的理想工具,是轉基因穩定表達系統的重要補充。在醫學領域,利用腺相關病毒 (adeno-associated virus, AAV) 包裝和體內遞送CRISPR-Cas基因是當前基因治療最有希望的系統之一,已在多種遺傳病治療的臨床試驗中表現出良好的效果。在植物學領域,儘管植物病毒表達載體系統也廣受關注,但CRISPR/Cas核酸酶基因較大的分子量(包括轉錄順式元件可達5-6 kb),遠超出了已知的大多數植物病毒載體的包容極限(1-2 kb),目前尚未有利用侵染性植物病毒載體系統遞送CRISPR/Cas核酸酶的成功報道。


2020年6月29日,Nature Plants在線發表了浙江大學李正和教授研究組題為Highly efficient DNA-free plant genome editing using virally delivered CRISPR-Cas9 的研究論文。該研究首次報道了利用一種工程化的植物負鏈RNA彈狀病毒載體向植物體內系統遞送CRISPR/Cas9核酸內切酶,並高效產生可穩定遺傳的靶向基因編輯。值得一提的是,Nature Plants同期還配發了題為Editing through infection的評論文章,對該該研究進行了詳細的介紹。

​浙江大學開發植物DNA-free基因編輯新系統

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該課題組前期實現了植物負鏈RNA病毒遺傳操作技術的突破,為病毒載體構建提供了可能【5】。在此基礎上,研究者將CRISPR/Cas9表達框插入彈狀病毒載體,並在gRNA序列兩側連接tRNAGly前體序列【6】,以便利用細胞內源tRNA加工機器對病毒轉錄的gRNA末端進行精確剪切。重組病毒接種本氏煙可有效形成系統侵染並表達Cas9/gRNA分子,在系統組織中對轉基因GFP靶點產生了可高達90%以上靶向編輯。該重組病毒載體可以通過汁液摩擦傳代,並維持CRISPR/Cas9穩定表達和高效編輯。電鏡觀察表明,該彈狀病毒通過成比例地擴展病毒粒子的長度來包容病毒基因組中較大外源基因片段的插入,這為其異乎尋常的基因組穩定性和承載能力提供了一種可能的解釋。


進一步研究發現,病毒載體遞送的CRISPR/Cas9對多個內源基因靶點均表現出較高的編輯頻率(40-91%不等)。利用tRNA加工原理,通過對多個gRNA進行串聯表達,可以方便實現多靶標編輯和染色體缺失等操作,且編輯效率與單靶標載體相當。


研究者對病毒侵染的葉片組織在無選擇的培養基進行培養,對獲得的30個M0再生植株進行基因分型(Genotyping)發現,再生植株中93%攜帶靶向編輯,其中高達57%攜帶純和突變或四等位基因突變(煙草為異源四倍體),其中少數植株已脫除了病毒。該研究進一步測定了部分植株的M1和M2後代的基因型和表型,結果表明,產生的基因編輯可在後代中穩定遺傳,傳遞規律符合經典的孟德爾遺傳定律。由於彈狀病毒無法通過種子傳播,所有的M1和M2後代植株均不攜帶病毒。

​浙江大學開發植物DNA-free基因編輯新系統


RNA病毒複製過程不涉及DNA階段,病毒基因組無法整合到寄主植株染色體,因而編輯植株不含有外源DNA片段。總之,該研究提供了一種不依賴於遺傳轉化、無需分離特定的受體細胞或組織、通過簡單易行的病毒侵染方法,可在植株個體水平遞送CRISPR/Cas核酸酶進行高效基因組編輯的新方法,為作物DNA-free基因組編輯提供了新的思路。在病毒學領域,研究結果揭示了彈狀病毒獨特的生物學特性,發展了病毒載體新的應用方向。


浙江大學生物所馬曉楠博士研究生為該論文第一作者,李正和教授為通訊作者,研究生張曉艷和劉慧敏也參與部分工作。中國農科院植保所周雪平教授、美國加州大學伯克利分校Andrew Jackson教授和浙江大學舒慶堯教授為研究提供了重要的幫助和建議。該研究得到國家自然科學基金面上項目、浙江省國家自然科學基金重點項目的資助。


參考文獻:1. Jupe, F. et al. The complex architecture and epigenomic impact of plant T-DNA insertions. PLoS Genet.15, e1007819 (2019).2. Liu, J. et al. Genome-scale sequence disruption following biolistic transformation in rice and maize. Plant Cell31, 368-383 (2019).3. Voytas, D. F. & Gao, C. Precision genome engineering and agriculture: opportunities and regulatory challenges. PLoS Biol.12, e1001877 (2014).4. Zhang Y, Malzahn AA, Sretenovic S, Qi Y. The emerging and uncultivated potential of CRISPR technology in plant science. Nat Plants5, 778-794 (2019).5. Wang, Q. et al. Rescue of a plant negative-strand RNA virus from cloned cDNA: Insights into enveloped plant virus movement and morphogenesis. PLoS Pathog. 11, e1005223 (2015).6. Xie, K., Minkenberg, B. & Yang, Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proc. Natl Acad. Sci. USA.112, 3570-3575 (2015).


論文鏈接:https://doi.org/10.1038/s41477-020-0704-5